PART 01

引言

多肽是由多個氨基酸（2≤N≤50）通過酰胺鍵連接形成的一類化合物，其分子大小介于小分子化藥和大分子生物藥之間。與小分子化藥相比，多肽具有更高的功效、選擇性和特異性以及更低的代謝毒性；與大分子生物藥比，多肽具有更低的免疫原性，能更深入的滲透到目標組織，且連續(xù)生產(chǎn)成本更低。基于這些獨特的優(yōu)勢，近年來，多肽類藥物越來越受到關(guān)注，據(jù)統(tǒng)計，肽藥物市場的增長速度是其他藥物的兩倍，目前已有上千種肽類藥物進入市場，用于治療糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、癌癥、多發(fā)性硬化癥、慢性疼痛、HIV感染等多種疾病。在多肽藥物興起的初期，由于多肽藥物的特殊性，針對多肽藥物的指導原則并不多，且對多肽性質(zhì)的了解也不夠深入。隨著多肽藥物數(shù)量的增加和對多肽性質(zhì)理解的不斷加深，針對多肽的指導原則也在不斷地更新和擴充，美國和歐洲藥典中均有多個關(guān)于合成多肽原料藥質(zhì)量控制的相關(guān)章節(jié)，2022年9月EMA發(fā)布了“關(guān)于制定合成肽和合成寡核苷酸研發(fā)生產(chǎn)指南”的概念文件，我國SFDA也于今年更新了《化學合成多肽藥物藥學研究技術(shù)指導原則》，這些指導原則為我們進行多肽類藥物研發(fā)提供了重要的參考和指引。我們知道，活性肽是產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此在肽藥物的開發(fā)過程中，對活性肽（API）進行質(zhì)量控制是十分重要的，而肽相關(guān)雜質(zhì)的控制又是質(zhì)量控制的重要工作，雜質(zhì)不僅影響用于臨床試驗樣品的質(zhì)量和**性，在藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段，這些雜質(zhì)還可能影響藥效的判斷，雜質(zhì)研究不到位甚至可能導致錯誤的結(jié)論。由于在國內(nèi)外批準的治療肽藥物中合成多肽占多數(shù)（大于70%），因此今天主要探討的是合成多肽的相關(guān)雜質(zhì)以及可能的產(chǎn)生途徑，以期對包裝、儲存條件選擇及制劑**開發(fā)提供一定的指導。

PART 02

雜質(zhì)分類及產(chǎn)生途徑

2.1 合成過程相關(guān)雜質(zhì)

化學合成技術(shù)是多肽生產(chǎn)的金標準，該工藝*初在溶液中進行，后來引入了固相肽合成，固相肽合成一經(jīng)問世就受到研發(fā)者的偏愛，幾十年來不斷發(fā)展與成熟，已穩(wěn)坐化學合成的**把交椅。化學合成多肽的步驟包括：掛樹脂-去保護基-活化和交聯(lián)-肽切割。在這個過程中去保護基和活化與交聯(lián)的步驟容易產(chǎn)生雜質(zhì)，通常是需要質(zhì)控的點。

圖1 固相合成流程簡圖及相關(guān)雜質(zhì)的產(chǎn)生途徑

1

缺失肽

顧名思義，缺失肽即是缺失一個或多個所需氨基酸的多肽，不完全去除氨基酸的瞬時保護集團、即將結(jié)合的氨基酸活化不足或交聯(lián)效率低都會導致缺失肽的產(chǎn)生。缺失肽的鑒定方法，即質(zhì)譜中觀察到的雜質(zhì)與目標肽之間的質(zhì)量差為所缺失氨基酸分子量減去水。例如，某合成多肽藥物A目標分子量為1311.5，在樣品中檢測出分子量1103.5的雜質(zhì)，與母肽分子量相差208，初步推測至少缺失2個氨基酸，經(jīng)過推算當缺失脯氨酸（分子量：115）及5-氧代脯氨酸（分子量：129）時所得雜質(zhì)分子量=1311.5-115+18-129+18=1103.5，與所檢測到的該雜質(zhì)質(zhì)荷比相符合。

圖2 某合成多肽藥物A的質(zhì)譜圖

圖3 某合成多肽藥物A缺失肽的質(zhì)譜圖

2

插入肽

在合成多肽交聯(lián)過程中通常會將氨基酸過量投料，如果過量的氨基酸未被充分洗滌或者反應(yīng)時間過長會將氨基酸再次交聯(lián)，產(chǎn)生插入肽。對于插入肽的鑒定方法，即質(zhì)譜中觀察到的雜質(zhì)與目標肽之間的質(zhì)量差為所插入氨基酸分子量減去水。例如：上述某合成多肽藥物A目標分子量為1311.5，在樣品中檢測出分子量1474.9的雜質(zhì)，與母肽分子量相差163.4，初步推測插入酪氨酸，酪氨酸分子量為181，雜質(zhì)分子量=1311.5+181-18=1474.5，與所檢測到的該雜質(zhì)質(zhì)荷比相符合。

圖4 某合成多肽藥物A插入肽的質(zhì)譜圖

3

錯結(jié)肽

當固相反應(yīng)過程中既發(fā)生氨基酸缺失又發(fā)生氨基酸插入時就會產(chǎn)生錯結(jié)肽。

4

共價附著肽雜質(zhì)

在固相合成完成后長久性保護基團不完全去除將導致保護基共價附著在肽序列中，產(chǎn)生共價附著肽雜質(zhì)。對于這類雜質(zhì)的鑒定方法，如果質(zhì)譜中雜質(zhì)分子量與目標肽分子量相差56 Da，那么附著的保護基為tBu保護基，如果質(zhì)譜中雜質(zhì)分子量與目標肽分子量相差100 Da，那么附著的保護基為tBoc-TCS保護基。

2.2 降解相關(guān)雜質(zhì)

降解相關(guān)雜質(zhì)包括制造過程中通過降解機制形成的雜質(zhì)和儲存過程中通過降解機制形成的雜質(zhì)。引起多肽不穩(wěn)定的因素包括氧化、光照、高溫、pH、離子強度變化及吸附等，肽鏈中氨基酸種類及氨基酸所在的位置對多肽的穩(wěn)定性有重要影響。因穩(wěn)定性而產(chǎn)生的肽雜質(zhì)包括：

1

差向肽

差向肽是指序列中含有1個或多個非預期手性構(gòu)型的氨基酸殘基所形成的雜質(zhì)，其產(chǎn)生可能源于起始物料中的光學異構(gòu)體，也可能是合成過程中氨基酸手性中心烯醇化或氮雜內(nèi)酯化形成。差向肽雜質(zhì)的色譜行為與主成分非常接近，分子量也與主成分一樣，僅此分離和鑒定難度較大?？刹捎秒噭Χ嚯倪M行水解并衍生化處理，通過水解所得氨基酸的手性異構(gòu)體的含量判斷肽鏈中易發(fā)生消旋的氨基酸，通過定向制備可能的差向異構(gòu)體肽進行有針對性的研究。

圖5 差向肽形成機制（A）烯醇化（B）氮雜內(nèi)脂化

2

缺失肽（斷裂肽）

此處的缺失肽與合成過程中的缺失肽不同，此處主要是指斷裂肽。多肽化合物在遇到高溫或pH變化時可能發(fā)生肽鍵斷裂，產(chǎn)生斷裂肽，有研究表明堿性條件*易引起肽鍵斷裂。斷裂肽的鑒定相對簡單，通過雜質(zhì)與母肽的分子量差可以推斷是哪個酰胺鍵斷裂。

3

脫酰胺雜質(zhì)

當多肽中含有谷氨酰胺或天冬酰胺殘基時，可能脫去酰胺鍵形成谷氨酸或天冬氨酸殘基，形成的機制有兩種，一是直接水解（pH<5時容易發(fā)生），二是通過β轉(zhuǎn)變（堿性條件下易發(fā)生），β轉(zhuǎn)變通過主鏈中酰胺鍵的N原子攻擊側(cè)鏈上的羰基，形成琥珀酰亞胺環(huán)（氮雜內(nèi)酯的一種），在堿性或中性條件下水解形成羧基。琥珀酰亞胺水解過程往往還伴隨著兩個副反應(yīng)即異構(gòu)化和外消旋化，*終形成4個分子量相同的異構(gòu)體產(chǎn)物。脫酰胺雜質(zhì)的鑒定主要通過質(zhì)譜，檢測到分子量+1 Da的雜質(zhì)通常是脫酰胺雜質(zhì)。

圖6天冬酰胺脫酰胺雜質(zhì)產(chǎn)生機制

4

異構(gòu)化雜質(zhì)

天冬氨酸是容易產(chǎn)生異構(gòu)化的氨基酸，天冬氨酸容易因側(cè)鏈失水或氨而環(huán)化到主鏈，形成琥珀酰亞胺，琥珀酰亞胺穩(wěn)定性較差，易水解開環(huán)，在開環(huán)的過程可形成異構(gòu)體，同時還會產(chǎn)生差向肽副產(chǎn)物，其生成機制與天冬酰胺脫酰胺相似。

圖7天冬氨酸相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)生機制

二嗪哌酮是指N端活性基團（通常為氨基）進攻β位主鏈酰胺鍵的羰基，形成二酮哌嗪類似物，得到缺失兩個氨基酸的缺失肽，當N端氨基酸位阻較小時反應(yīng)更容易發(fā)生。

圖8 二嗪哌酮雜質(zhì)產(chǎn)生機制

焦谷氨酸是指N-端含有的谷氨酸發(fā)生環(huán)化形成吡咯烷酮羧酸。該雜質(zhì)的鑒定可采用質(zhì)譜，分子量較母肽減少17Da（脫去NH3）。

圖9 焦谷氨酸相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)生機制

6

聚合物

多肽分子間聚集和自結(jié)合可導致高分子量雜質(zhì)也就是聚合物的形成。聚合機制有共價和非共價兩種，非共價聚合通過靜電或疏水相互作用形成，是一種中間狀態(tài)，當溶液濃度、pH或離子強度發(fā)生變化時，這種作用力容易減弱或消失，聚合狀態(tài)恢復到單體狀態(tài)；當肽鏈中含有巰基或酪氨酸時可通過生成二硫鍵或形成二酪氨酸而引起共價聚合，共價聚合是一種穩(wěn)定的聚合狀態(tài)，不會隨肽濃度或pH、離子強度等而改變聚合狀態(tài)。聚合物雜質(zhì)由于其分子量和體積的進一步加大，容易增加免疫原性，引起過敏性反應(yīng)，因此應(yīng)合理控制聚合物的含量。聚合物的檢測通常采用體積排阻色譜，與質(zhì)譜聯(lián)用后可以判斷其聚合體的倍數(shù)。

7

氧化雜質(zhì)

氧化雜質(zhì)是多肽在儲存過程中接觸氧氣和光的情況下形成的，易發(fā)生氧化的氨基酸包括含硫氨基酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸。①含有硫的氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸）容易發(fā)生氧化反應(yīng)，氧化途徑有兩種，一是生成二硫鍵，雜質(zhì)分子量為母肽分子量2倍減2，二者生成亞砜、砜和磺酸，雜質(zhì)分子量與母肽的分子量通常相差16Da、32Da或48Da（圖10 A、B）。②酪氨酸中酚羥基及臨位均可成為氧化位點，氧化會生成2-氨基-3-(3,4-二氧環(huán)己-1,5-二烯基)丙酸，分子量增加14（圖10 C）。③組氨酸氧化有兩種途徑，一是咪唑環(huán)的雙鍵氧化成羰基，其氧化雜質(zhì)與母肽分子量相差16Da，另一種氧化途徑是生成n -甲?；虬彼?，分子量相差48（圖10 D）。④色氨酸在氧化條件下可生成羥色氨酸（分子量增加16Da）或犬色氨酸（分子量增加4Da），犬色氨酸進一步氧化可生成羥基-甲酰犬尿氨酸（分子量增加48Da）（圖10 E）。

圖10 多肽氧化的降解機制

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其他雜質(zhì)

多肽除發(fā)生以上降解外還會在還原劑存在的條件下發(fā)生還原反應(yīng)，如二硫鍵還原為巰基，這一反應(yīng)與相應(yīng)的氧化反應(yīng)形成動態(tài)平衡。此外，物理不穩(wěn)定性也是需要關(guān)注的問題，如與包材、濾膜等發(fā)生吸附或當多肽分子微環(huán)境發(fā)生變化時其**結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等，這些都可能引起藥效改變或產(chǎn)生**性的風險。PART 03

小結(jié)

多肽的肽相關(guān)雜質(zhì)不僅是藥物開發(fā)和生產(chǎn)過程中GMP監(jiān)管需要持續(xù)關(guān)注的問題，在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的早期階段還可能因為雜質(zhì)的拮抗作用或超強的藥效引起研發(fā)者的誤判，因此通常在開展生物試驗時，建議采用不同來源的肽進行復測，以排除雜質(zhì)對藥效的影響。

合成過程相關(guān)的肽雜質(zhì)包括fmoc脫保護效率低下、氨基酸活化不足或交聯(lián)效率低下、氨基酸過量或反應(yīng)時間過長引起的缺失肽、插入肽。與穩(wěn)定性相關(guān)的雜質(zhì)包括差向肽、斷裂肽、脫酰胺雜質(zhì)、異構(gòu)化雜質(zhì)、聚合物、二嗪哌酮和焦谷氨酸、氧化等。了解多肽類藥物雜質(zhì)產(chǎn)生的原因，我們不僅可以對容易產(chǎn)生雜質(zhì)的合成步驟進行監(jiān)控，在后續(xù)制劑**設(shè)計和儲存過程中我們也可依據(jù)由于多肽不穩(wěn)定所產(chǎn)生雜質(zhì)的產(chǎn)生機制有針對性的設(shè)計**工藝和儲存條件，確保多肽藥物的質(zhì)量在可接受范圍內(nèi)。